×

Дорогие друзья!

Совсем скоро запуск нашего нового сайта, где будет всё самое интересное!

Актуальная информация по тел. 8 800 333 12 26, 8 456 215 02 22 или у наших менеджеров.

Реактивы и оборудование
для лабораторий

#11 Решения от New England Biolabs для секвенирования следующего поколения (Next Generation Sequencing, NGS)

Все большее внимание в последние годы уделяется методам севенирования следующего поколения (Next Generation Sequencing, NGS), которые благодаря своей высокой производительности постепенно вытесняют другие методики, такие как, например, автоматическое секвенирование по Сэнгеру. В сегодняшнем обзоре мы расскажем, что же представляет собой NGS, и какие продукты компании New England Biolabs помогут решить задачи по секвенированию образцов ДНК и РНК.

На первом этапе давайте ответим на вопрос: что такое NGS?

Технологии секвенирования NGS основаны на анализе последовательности присоединяемых нуклеотидов в множестве происходящих параллельно реакций амплификации. На сегодняшний день, наиболее распространенными платформами для секвенирования являются Illumina®, 454™, SOLiD™, Ion Torrent&trade. Каждая компания-производитель использует свой собственный подход для детекции присоединяемого нуклеотида.

В целом, если вы поставите перед собой задачу провести секвенирование образца с использованием NGS, следующий алгоритм действий, при правильной постановке экспериментов, обеспечит требуемый результат:

  1. Выделить образец ДНК/РНК
  2. Подготовить образцы для проведения секвенирования: получить библиотеку, годную для дальнейшего секвенирования. Библиотека NGS - это совокупность фрагментов исследуемого образца ДНК/РНК одинаковой длины, при этом каждый из фрагментов модифицирован соответствующим для своего метода образом.
  3. Загрузить библиотеку в секвенатор и получить массив данных с информацией о последовательности различных фрагментов библиотеки.
  4. Проанализировать полученные данные с использованием программы-сборщика и сформировать последовательность ДНК/РНК целиком.

Несмотря на кажущуюся простоту алгоритма анализа, существует огромное количество подводных камней и деталей, которые необходимо учесть при проведении эксперимента.

Общие рекомендации при подготовке библиотек ДНК

Используйте самые качественные образцы ДНК из доступных. Качество исходного материала напрямую влияет на характеристики полученной библиотеки. Для оценки целостности и степени загрязненности ДНК можно использовать электрофорез. Смазанные полосы или «лестницы» на геле свидетельствуют о повреждении ДНК или о попадании в пробу детергентов или загрязняющих веществ. Наличие РНК можно детектировать внизу геля. С помощью измерения поглощения в УФ также можно оценить чистоту образца. В идеальных пробах соотношение оптического поглощения при 260 и 280 нм должно быть порядка 1,8 – 2,0. Однако на результаты этих измерений может повлиять наличие в пробе РНК или коротких фрагментов ДНК.

Очень важно точно оценить исходное количество ДНК, используемое для создания библиотеки. Использование флуоресцентных красителей, специфично связывающихся с двуцепочечных ДНК позволяет измерять количество ДНК намного точнее, чем измерения в УФ (Qubit, Life Technologies). Этот метод позволяет исключить вклад загрязнителей, РНК и коротких фрагментов ДНК.

Для очистки ДНК после каждого из этапов пробоподготовки,согласно протоколу NEBNext, рекомендуется воспользоваться AMPure XP® Beads (Beckman Coulter, Inc).

Общие рекомендации при подготовке библиотек РНК

Очень важно использовать РНК высокого качества. Образцы с частично деградированной РНК могут привезти к низкому выходу, или к получению библиотеки неприемлемого качества. Мы рекомендуем определять индекс целостности выделенной РНК (RIN) на анализаторах Bioanalyzer (Agilent). Образец должен иметь RIN выше 7.

Целостность и распределение длин фрагментов РНК может быть проверена электрофоретически в денатурирующем агарозном геле с окраской бромидом этидия. Полосы рибосомальной РНК должны быть четкими. В образцах общей РНК эукариот четкие яркие полосы будут соответствовать 28S и 18S рРНК. Полоса 28S должна быть примерно в два раза более интенсивной, чем полоса 18S рРНК. Соотношение 2:1 является хорошим знаком целостности РНК. Частично деградировавшая РНК будет образовывать на геле смазанные полосы, и соотношение рРНК будет отличаться от 2:1. Полностью деградировавшая РНК на геле выглядит как смазанная зона в низкомолекулярной области геля.

Образцы РНК должны быть полностью очищены от ДНК. Рекомендуется обрабатывать выделенную РНК ДНКазой, не имеющей РНКазной активности.

Для очистки РНК рекомендуем воспользоваться модулем NEBNext для выделения поли(А) мРНК с помощью магнитных шариков, который не входит в состав наборов для пробоподготовки библиотек РНК, и заказывается отдельно.

После приготовления библиотеки очень важно оценить ее качество при помощи Bioanalyzer (Agilent) и количественной ПЦР.

Компания New England Biolabs предлагает реактивы NEBNext, обеспечивающие полный цикл подготовки библиотек NGS высокого качества. Вообще, процедура секвенирования NGS доступна не только лабораториям, которые приобрели секвенатор NGS – все больше лабораторий самостоятельно готовят библиотеки NGS и далее отдают их на анализ в центры коллективного пользования. Стоимость секвенирования в пересчете на один нуклеотид падает за счет увеличения производительности. При этом современные приборы позволяют проанализировать за один прогон большее количество образцов, чем требуется отдельной лаборатории или даже небольшому институту.

Пробоподготовка для различных платформ NGS

Учитывая указанные требования и потребности, компания New England Biolabs (NEB) разработала серию реактивов NEBNext® для NGS на платформах Illumina®, 454™, SOLiD™, Ion Torrent™, предлагаемых мировыми лидерами в области NGS. Реактивы NEBNext® доступны в следующих комплектациях:

  1. Наборы реактивов – содержат ферменты, нуклеотиды и буферы, необходимые для проведения всех этапов пробоподготовки.
  2. Наборы реактивов в виде готовых смесей содержат те же компоненты, что и наборы реактивов, но их более удобно использовать, что ускоряет процесс пробоподготовки.
  3. Модули – содержат компоненты, необходимые для проведения отдельных этапов пробоподготовки, позволяют подстраивать процесс под определенные задачи.

В данном обзоре мы по большей части обсуждаем наборы, обеспечивающие полный цикл пробоподготовки. Реактивы NEBNext применяются для создания библиотек ДНК, Chip-Seq библиотек, библиотек мРНК, библиотек малых РНК, экспрессионных библиотек и дальнейшего секвенирования на различных платформах.

NEBNext для создания ДНК-библиотек для Illumina

NGS_obzor_1.png

Рис.1. Набор NEBNext

Все рассматриваемые реактивы прошли функциональную валидацию путём создания библиотек и последующего секвенирования на платформах HiSeq, MiSeq, Genome Analyzer IIx и HiScan компании Illumina.

Адаптеры и праймеры поставляются отдельно от наборов NEBNext, это позволяет увеличить количество комбинаций адаптеров, праймеров и реактивов друг с другом.

На первом этапе, в случае приготовления библиотек ДНК – необходима фрагментация исходного образца ДНК до определенной длины. Если в вашей лаборатории не используется для фрагментации ультразвук или небулизация, NEB предлагает воспользоваться фрагментазой NEBNext для двуцепочечной ДНК которая позволит получить фрагменты ДНК в заданном диапазоне длин.

После анализа полученных фрагментов ДНК, проводится реакция восстановления концов и их фосфорилирования. Далее на 3’-конец прикрепляют аденин, чтобы произошло узнавание адаптеров, которые имеют тимидин на 3’-конце.

Далее проводят лигирование к концам полученных фрагментов адаптеров – это в случае Illumina шпилеобразные олигонуклеотиды, последовательность которых будет узнаваться секвенатором.

Далее, фрагменты ДНК, составляющие библиотеку, и присоединенные к ним шпилеобразные адаптеры, содержащие урацил в середине, обрабатываются ферментом урацилгликозилазой USER, которая позволяет получить линейные адаптеры на концах фрагментов ДНК.

И наконец, на последнем этапе полученные фрагменты амплифицирует при помощи высокоточной ДНК-полимеразы. При этом, на данном этапе, кроме увеличения количества копий, возможно избавиться от фрагментов, к которым адаптеры не прикрепились на оба конца, а также ввести на концы фрагментов праймеры (в случае мультиплексирования - также индекс праймеры). Праймеры понадобятся при процессе секвенирования.

Схема процесса пробоподготовки с использованием NEBNext представлена ниже на Рис.2.

Если перед вами стоит задача секвенирования образцов ДНК - то можно воспользоваться готовыми наборами: например набором реактивов NEBNext Ultra для создания геномных библиотек для Illumina и готовой смесью NEBNext для создания геномных библиотек для Illumina.

Различия между двумя наборами состоят в том, что набор Ultra оперирует меньшими количествами исходного образца ДНК, а протокол занимает меньшее время. Поэтому набор Ultra рекомендуется начинающим работать с NGS.

Для приготовления ChIP-Seq библиотек можно воспользоваться набором реактивов в виде готовой смеси NEBNext для создания библиотек ChIP-Seq для Illumina, а также набором реактивов NEBNext для создания библиотек ChIP-Seq для Illumina.

Мультиплексирование образцов

NGS_obzor_2.png

Рис.2. Схема пробоподготовки с использованием NEBNext, с мультиплексированием

Выше уже упоминалось, что на этапе амплификации библиотеки можно воспользоваться одним комплектом праймеров или несколькими индекс праймерами. В первом случае, необходимо выбрать набор олигонуклеотидов NEBNext Singleplex для Illumina, и в таком случае в одном запуске Illumina может анализироваться один образец. Если стоит задача проанализировать за один раз несколько образцов, тогда необходимо воспользоваться возможностями мультиплексирования.

Чтобы на этапе анализа последовательностей образцов после секвенирования возможно было отличить образцы друг от друга - каждый образец использует праймеры с разными индексами (разными сигнальными последовательностями олигонуклеотидов) - для этого можно использовать набор олигонуклеотидов NEBNext Multiplex для Illumina (набор праймеров №1), или набор олигонуклеотидов NEBNext Multiplex для Illumina (набор праймеров №2).

Схематическое расположение индексов и праймеров представлено на Рис.2.

Наборы олигонуклеотидов NEBNext Multiplex содержат праймеры, достаточные для создания 12 мультиплексных библиотек. Праймеры имеют одинаковую нуклеотидную последовательность, за исключением последовательности из 6 нуклеотидов, которая у каждого праймера уникальна. Эту последовательность называют индексом, поскольку именно она позволяет идентифицировать, к какой библиотеке принадлежит фрагмент ДНК. Последовательности праймеров указаны в инструкциях к наборам.

Технология мультиплексирования была усовершенствована с появлением нового продукта NEB: набора олигонуклеотидов NEBNext с двойным баркодированием для Illumina (набор на 96 реакций). В данном случае используются два участка в 8 нуклеотидов для идентификации образца - по одному на каждом из праймеров. Возможно зашифровать 96 образцов с использованием лишь 20 пробирок с различными индексами (12+8). Двойное баркодирование существенно увеличивает точность отбора фрагментов при сборке последовательности различных образцов, так как идентификация каждого образца происходит дважды.

При планировании эксперимента с использованием NEBNext для Illuina, кроме набора для подготовки библиотеки важно не забыть включить в заказ один из наборов олигонуклеотидов, а также фрагментазу, если не планируется фрагментация при помощи небулизации или ультразвука.

Реактивы NEBNext для создания библиотек РНК, малых РНК и микро-РНК для Illumina

Для секвенирования образцов РНК, в процессе пробоподготовки их переводят в кДНК, и далее проводят пробоподготовку аналогично библиотеки ДНК. Дли приготовления библиотеки РНК воспользуйтесь набором реактивов NEBNext Ultra Directional для создания библиотек РНК для Illumina и набором реактивов NEBNext Ultra для создания библиотек РНК для Illumina.

Зачастую стоит задача по секвенированию малых РНК - в таком случае пользуются набором NEBNext Multiplex для создания библиотек малых РНК для Illumina (набор праймеров №1,№2) или набором реактивов NEBNext для создания библиотек малых РНК для Illumina.

Дополнительно есть возможность при помощи набора реактивов NEBNext для создания библиотек мРНК для Illumina подготовить для секвенирования экспрессионные библиотеки.

Реактивы NEBNext для создания ДНК-библиотек для Ion Torrent

Для пользователей Ion Torrent NEB предлагает два набора для создания ДНК-библиотек: набор реактивов NEBNext для быстрой фрагментации и создания геномных библиотек для Ion Torrent, и набор реактивов NEBNext для быстрого создания геномных библиотек для Ion Torrent (в данном случае в набор не включены реактивы для фрагментации ДНК).

В отличие от реактивов для Illumina, нет необходимости заказывать набор олигонуклеотидов отдельно, он уже включен в набор. Однако следует учитывать, что для данной платформы также существует возможность мультиплексирования, но с использованием набора олигонуклеотидов для мультиплексирования от Applied Biosystems. В таком случае в протоколе NEBNext просто используются олигонуклеотиды с мультиплексными индексами.

Реактивы NEBNext для создания библиотек малых РНК для SOLiD

Для пользователей данной платформы New England Biolabs предлагает воспользоваться набором реактивов NEBNext для создания библиотек малых РНК для SOLiD.

Реактивы NEBNext для создания ДНК-библиотек для 454/Roche

NEB предлагает воспользоваться набором готовых смесей NEBNext для быстрого создания геномных библиотек для 454 или набором готовых смесей NEBNext для создания геномных библиотек для 454.

Следует, однако иметь в виду, что наборы олигонуклеотидов NEB не предоставляет, и для проведения полноценного эксперимента необходимо использовать олигонуклеотиды от Roche.

Мы искренне надеемся, что представленная информация будет полезна в вашей ежедневной работе!

к списку обзоров